Этап 1
Анализ лит-ры, изучение и сравнительный анализ методов. Начало экспериментов.
1. Литературный обзор
По результатам обзора литературы была определена новизна и актуальность метода ИФА для определения антибиотиков в продуктах питания.
Список проанализированной литературы:
  1. Рощина Т.М., Ермилов А.Ю. Практикум по физической химии.
  2. C. Wagner. Adapting blood glucose meter biosensors for the measurement of lactose in dairy ingredients.
  3. Naveen K. Singh. Hitting the diagnostic sweet spot: Point-of-care SARS-CoV-2 salivary antigen testing with an off-the-shelf glucometer.
  4. Haoran Liu. Construction of a portable immunosensor for the sensitive detection of carbendazim in agricultural products using a personal glucose meter
2. Сравнительный анализ альтернативных методов
Методы определения фторхинолоновых антибиотиков
Название метода
Недостатки
Преимущества
ВЭЖХ
дороговизна исследования
чувствительность, точность, универсальность
Спектрофотометрия / Флуометрия
низкая селективность и
чувствительность
экспрессность
Микробиологические методы
качественное определение антибиотика
определение вида антибиотика
ИФА
длительность анализа
чувствительность селективность
3. Начало экспериментов
На 1 этапе была проведена оценка ферментной активности инвертазы. По результатам эксперимента сделан вывод о том, что инвертаза обладает требуемой (Км в пределах 1 до 10−8 моль⋅л−1) активностью: Км = 37·10-3 моль·л-1 и νмax = 1,6·10-3 моль·л-1·мин-1 . Полученные значения были определены с помощью уравнения Лайнвивера-Берка.
Методика анализа активности инвертазы
Инвертаза (100 мкл)
Лимонная кислота
(0.1 М, 150 мкл )
Сахароза
(1650 мкл)
Инкубация ( 30 мин, 45 °С)
буфер Трис + HCl pH = 10,
(1750 мкл)
Измерение концентрации сахарозы глюкометром
Этап 2
Исследование
каталитической активности коньюгатов инвертазы, пробоподготовка продуктов
питания для извлечения антибиотиков.
1. Синтез конъюгата
Методика синтеза конъюгата
Смесь (4 °С) :
Антитела (2 мг/мл) Фермент (5 мг/мл)
Фосфатный буфер
(0,02 М, pH = 7,4) + 0,15 М NaCl
10 мкл 25% глутарового альдегида на 1 мл р-ра антитело + фермент
Синтез конъюгата (2 часа)
10 мг/мл
NaBH4
Фильтрация 0,45 мкм
Очистка колоночной хроматографией
(Sephadex G-25),
Элюент - ФБР (pH = 7,4)
2. Проведение конкурентного ИФА с конъюгатом инвертазы
Методика конкурентного ИФА с инвертазой
Иммобилизованные
белковые конъюгаты
антибиотика + антибиотик
Конъюгат (100 мкл)
Инкубация ( 30 мин, 37 °С )
Отмывка
ФСБ – Т (фосфатно-солевой буфер + Твин)
( 350 мкл )
Сахароза (30 ммоль/л,
50 мкл, pH = 4÷5, 45 °С, 25 мин)
Трис+НСl
(50 мкл, pH 7÷8)
Замер концентрации глюкозы глюкометром
3. Пробоподготовка
Методика пробоподготовки
Взвесить 2 г гомогената (яйцо и фарш)
+ 0.1 мл р-р для экстракции
+ 6 мл ACN (ацетонитрил)
Вортекс (2 мин )
Центрифуга (5 мин)
Отобрать 2 мл надосадочной жидкости
Выпарить до сухого остатка (85°C)
+ Н-гексан (1 мл)
Вортекс (30 сек )
+ восстанавливающий буфер (2 мл)
Вортекс (2 мин )
Центрифуга (5 мин)
50 мкл жидкости из нижнего слоя
Этап 3
Определение антибиотиков в продуктах
питания с помощью
глюкометра и разработка макета тест-системы. Создание сайта проекта.
Был проведен анализ продуктов питания с помощью классического ИФА с пероксидазой хрена (HRP) и инвертазой (Inv).
Результаты анализа
Результатом нашей работы является универсальная тест-система для определения антибиотиков и определение содержание антибиотиков в еде. Тест-система состоит из паспорта продукта, глюкометра, емкостей с реактивами.
Данная тест-система позволит определять фторхинолоны в продуктах питания в домашних условиях без специального оборудования и навыков.
Made on
Tilda